【First-in-class药设系列】神经性疾病靶标ABHD12选择性抑制剂的发现

PHARC是一种神经性综合症的总称，包括多发性神经病(polyneuropathy)，听力损伤(hearing loss)，共济失调(ataxia)，色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)以及白内障(cataract)。近年来大量的证据表明，溶血磷酯酰丝氨酸（lyso-PS）脂肪酶ABHD12突变会导致PHRAC的发生。但是由于缺乏小分子，对于ABHD12-(lyso)-PS这条通路调控神经性疾病的机制是一个未知数。近日，美国斯克里普斯研究所的研究团队在Nature Chemical Biology上报道了最新发现的选择性ABHD12抑制剂—D0264，用于模拟疾病产生的原因，并确立ABHD12作为PHARC靶标的可能性。特别提示：D0264不是一个用于疾病治疗的先导化合物，而是用来确认疾病机制的活性小分子。

该团队首先开发了一种高通量筛选方法，相较于之前常用的利用花生四烯酸作为底物的筛选方法不同，他们利用一种选择性更强的以溶血磷脂为底物进行酶偶联荧光检测。在Maybridge HitFinder库的16000个化合物中筛选出了200种抑制率>50%的化合物，再通过两种机制不同的筛选方法（一种基于LC-MS的水解产物分析法；一种使用丝氨酸水解酶定向荧光探针的竞争性蛋白分析法）加以确认，去除假阳性化合物，最终得到IC50值为1.3μM的化合物DO-130。通过药物化学优化，保留其左边关键硫脲结构不变，改变其右边环上的取代基最终得到化合物DO264，其IC50值达到了1.1nM。

研究者也合成了DO264的手性异构体DO271，该化合物无抑制活性作为阴性对照。他们通过HEK293T细胞以及小鼠脑细胞裂解物的实验证实，相较于阴性化合物，DO-264能够抑制溶血磷脂水解，且DO264对ABHD12的抑制无共价修饰出现，说明了DO264对ABHD12的抑制是非共价可逆的。此外，研究者还发现溶血磷酯酰丝氨酸底物浓度依赖性地响应DO264的抑制效力，揭示DO264是与底物存在竞争性的抑制剂。由于ABHD12在巨噬细胞以及小神经胶质细胞中大量表达，他们采用了THP-1细胞（人单核细胞）作为模式细胞。研究结果表明DO264可以浓度依赖性地抑制ABHD12，特别重要的是，DO264处理后的THP-1细胞裂解物中只观察到了ABHD12这一种溶血磷酯酰丝氨酸水解酶活性的降低，而不影响其他丝氨酸水解酶的活性，再次验证该化合物对ABHD12具有的良好选择性。

该研究组前期工作发现，ABHD12-(lyso)-PS这条通路的免疫调控功能可能同时在先天及获得性免疫系统发挥作用，ABHD12敲除小鼠被CI13感染（免疫抑制）后会产生非常严重的病理状态如肺损伤，而存在ABHD12的小鼠感染后则健康得多。与之一致的是，DO264给药的CI13感染存在ABHD12的小鼠也会产生类似的严重病理现象，而给药ABHD12敲除小鼠则不会加重病理状态，说明DO264引起的免疫效应主要是从ABHD12介导的。因此，基于DO264分子，他们证实了ABHD12的抑制会增加肺损伤和后续的CI13病毒感染，说明该蛋白与免疫调控密切相关，其功能下降(如突变)是造成相关疾病(如PHARC)的重要原因。

近年来，关于神经性疾病的新靶点纷至沓来，这为研究发育与神经系统带来许多新机遇。然而利用敲除技术发现的功能是否真正能作为疾病相关蛋白加以干预，实际还有很长的路要走，特别是需要真正发现外源性化学分子干预获得与敲除一致的效应时才能确认其药理学的靶标作用。毕竟敲除技术是在体内去掉了目标蛋白，在去除其自身功能的同时也丧失了和其他蛋白的各种相互作用；而外源性化学分子只调控其蛋白功能而不影响自身蛋白的存在，依然可以维持和大部分周围环境的结合互动。因此，靶标的发现与确认离不开活性化学小分子的发现，即使发现的小分子并不是药效所需要的类型，依然可以为该靶标未来的药物开发提供药理学的机制保障。

参考文献

1. Daisuke Ogasawara, Taka-Aki Ichu, Vincent F. Vartabedian, Jacqueline Benthuysen, Hui Jing, Alex Reed, Olesya A. Ulanovskaya, Jonathan J. Hulce, Amanda Roberts, Steven Brown, Hugh Rosen, John R. Teijaro and Benjamin F. Cravatt. Selective blockade of the lyso-PS lipase ABHD12 stimulates immune responses in vivo. Nat Chem Biol, 2018, 14, 1099-1108.

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